Рекомендации по применению реагента моноклонального анти-D IgG для определения резус-фактора (антигена D системы Резус эритроцитов) человека. (Изосероклон^ТМ анти-D IgG)

Назначение реагента для анализа крови на наличие резус-фактора

Изосероклон^ТМ анти-D IgG диагностический жидкий предназначен для определения резус-фактора крови человека путем выявления антигена D эритроцитов, включая слабый антиген D (D^u) и варианты D^I - D^VII, в непрямом антиглобулиновом тесте (непрямая реакция Кумбса) или в реакции конглютинации с желатином в пробирочном тесте.

Реагент анти-D IgG может быть использован:

• в качестве дополнительного, уточняющего реагента для выявления частичных вариантов антигена D (D^I - D^VII) в образцах эритроцитов доноров, которые в реакции с Изосероклоном^ТМ анти-D IgM или другими моноклональными анти-D IgM реагентами были определены как D-отрицательные*;
• в качестве самостоятельного реагента для анализа на наличие резус-фактора: определения всех разновидностей антигена D эритроцитов человека - D; D^u ; D^I - D^VII.

Изосероклоны являются эквивалентами цоликлонов и в связи с этим при анализе крови для выявления резус-фактора к ним предъявляются те же требования, что и при определении резус-фактора цоликлонами.

Принцип действия реагента для определения резус-фактора

Принцип действия реагента для анализа на наличие резус-фактора основывается на реакции гемагглютинации. Реакция наступает в результате специфического взаимодействия антигенов D, D^u или D^I - D^VII эритроцитов человека с Изосероклоном^ТМ анти-D IgG.

Действующее начало реагента для определения резус-фактора анти-D IgG - человеческие моноклональные антитела класса IgG, продуцируемые гетерогибридомной линией клеток человек-мышь. Для производства реагента для определения RhD-принадлежности крови используется культуральная питательная среда, в которой в результате культивирования клеток гетерогибридомы содержатся анти-D IgG антитела.

Реагент анти-D IgG используют в непрямом антиглобулиновом тесте (непрямая реакция Кумбса) или в реакции конглютинации с желатином в пробирочном тесте путем смешивания Изосероклона^ТМ с исследуемыми образцами крови (эритроцитами).

Положительная реакция выражается в склеивании эритроцитов в отчетливо видимые агрегированные скопления клеток - агглютинаты, и просветлении поля реакции.

При отсутствии антигена D и его разновидностей (D^u; D^I - D^VII) на исследуемых эритроцитах агглютинация не появляется.

Состав комплекта

• 5 или 10 флаконов реагента для анализа крови на наличие резус-фактора (по 2,0; 5,0 или 10 мл в каждом).

Аналитические характеристики реагента

Специфичность:

• Изосероклон^ТМ анти-D IgG агглютинирует все разновидности D-положительных эритроцитов. Изосероклон^ТМ анти-D IgG не агглютинирует D-отрицательные эритроциты.

Титр:

• Титр Изосероклона^ТМ анти-D IgG в непрямом антиглобулиновом тесте (непрямая проба Кумбса) или в реакции конглютинации с желатином в пробирочном тесте - не менее 1:128.

Меры предосторожности

При работе с анализируемыми образцами крови следует использовать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, т.к. образцы крови человека необходимо рассматривать как потенциально инфицированный материал, способный длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита и др. возбудителей инфекций.

Анализируемые пробы

Определение резус фактора производится в нативной крови, взятой в консервант; в крови, взятой без консерванта, в том числе взятой из пальца.

Максимальный срок хранения образцов крови, предназначенных для исследования - не более 3 суток при температуре от + 2 до + 8 °С.

Оборудование, материалы и реагенты

• пробирки стеклянные круглодонные вместимостью 2,0 - 5,0 мл;
• пипетки пастеровские вместимостью 5,0 мл или полуавтоматическая пипетка со сменным объемом;
• физиологический раствор (0,9 % NaCl) или раствор с низкой ионной силой - LISS;
• антиглобулиновый реагент (сыворотка Кумбса);
• 10 % желатин;
• центрифуга, развивающая ускорение 2000 об./мин;
• термостат лабораторный или баня водяная, поддерживающие температуру + 37 ± 1 °С и + 48 ± 1 °С;
• перчатки резиновые или пластиковые;
• стандартные D-положительные и D-отрицательные эритроциты.

Проведение анализа

Анализ крови для выявления резус-фактора с использованием моноклональных реагентов проводится по одной общей методике, что и при определении резус-фактора цоликлонами.

Используется непрямой антиглобулиновый тест (непрямая проба Кумбса) или реакция конглютинации с желатином в пробирочном тесте.

Определение производится в помещении с хорошим освещением при комнатной температуре от 18 до 25 °С.

Порядок проведения анализа

Изосероклон^ТМ анти-D IgG может быть использован в непрямом антиглобулиновом тесте (непрямая проба Кумбса) или в реакции конглютинации с желатином в пробирочном тесте.

Непрямой антиглобулиновый тест (непрямая проба Кумбса).

• Приготовить образец исследуемой крови. Для этого в пробирку внести примерно 0,25 мл крови, три раза отмыть эритроциты в 5 мл физиологического раствора; ресузпендировать осадок в 2 - 3 мл физиологического раствора или в растворе с низкой ионной силой - LISS для получения 2 - 5 % суспензии исследуемых эритроцитов.
• Промаркировать чистую пробирку, указав фамилию, имя, отчество исследуемого лица.
• Внести в пробирку одну каплю (~ 0,1 мл) Изосероклона^ТМ анти-D IgG.
• Добавить одну каплю 2 - 5 % взвеси исследуемых эритроцитов, смешать с реагентом для анализа на наличие резус-фактора анти-D IgG.
• Инкубировать смесь в термостате или на водяной бане при температуре + 37 °С в течение 10 - 15 мин.
• Добавить в пробирку 5 мл физиологического раствора. Центрифугировать пробирку со смесью в течение 2 - 5 мин. при 2000 об./мин. Полностью удалить физиологический раствор.
• Добавить одну каплю (~ 0,1 мл) антиглобулинового реагента для определения резус-фактора к осадку эритроцитов и тщательно перемешать.
• Центрифугировать пробирку с исследуемым образцом эритроцитов в течение 15 - 20 секунд при 2000 об./мин.
• Осторожно ресуспендировать осадок эритроцитов и визуально определить наличие или отсутствие агглютинации. При положительном результате на дне пробирки образуется один или несколько крупных агглютинатов на фоне прозрачного раствора. Менее выраженная агглютинация свидетельствует о наличии на эритроцитах вариантов антигена D (D^I - D^VII). В случае отрицательного результата реакции осадок легко разбивается и представляет собой непрозрачную суспензию эритроцитов.

Реакция конглютинации с желатином в пробирочном тесте.

• Промаркировать чистую пробирку, указав фамилию, имя, отчество исследуемого лица.
• В пробирку внести одну каплю (0,05 - 0,1 мл) исследуемой крови.
• Добавить две капли по 0,1 мл 10 % желатина, предварительно прогретого в термостате или на водяной бане при температуре + 48 °С до разжижения.
• Добавить две капли по 0,1 мл Изосероклона^ТМ анти-D IgG, тщательно перемешать суспензию.
• Инкубировать в течение 10 - 15 мин. на водяной бане или 30 мин. в термостате при температуре + 48 °С.
• Добавить в пробирку 5 мл физиологического раствора, закрыть её резиновой пробкой, а затем осторожно перевернуть пробирку 1 - 2 раза.
• Результаты реакции учесть визуально. При положительном результате образуется один или несколько крупных агглютинатов на фоне прозрачного физиологического раствора. Менее выраженная агглютинация свидетельствует о наличии на эритроцитах вариантов антигена D (D^I - D^VII). При отрицательном результате образуется равномерная, непрозрачная суспензия эритроцитов.

Контроль специфичности

Для контроля специфичности (независимо от применяемой методики исследования) с каждой серией анализируемых образцов крови необходимо проводить контрольные исследования Изосероклона^ТМ анти-D IgG со стандартными D-положительными и D-отрицательными эритроцитами.

Результаты учитывают только при наличии правильной реакции Изосероклона^ТМ анти-D IgG со стандартными эритроцитами.

Условия хранения и эксплуатации реагента для определения RhD-принадлежности крови

Реагент должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре от 2 до 8 °С в течение всего срока годности. Допускается хранение реагента при температуре до + 25 °С не более 10 сут.

Вскрытые флаконы с реагентом можно хранить при температуре от 2 до 8 °С в плотно закрытом виде не более 1 мес.

По вопросам, касающимся качества реагента Изосероклон^ТМ анти-D IgG, следует обращаться в Фонд развития медицинских и биологических технологий "МеДиКлон" по адресу: 190108, Санкт-Петербург, Рижский пр., д. 2, тел.: 8 (812) 325-66-19; или в Институт государственного контроля лекарственных средств ФГУ "НЦ ЭСМП" Росздравнадзора, по адресу: 117246, г. Москва, Научный проезд, д. 14а, тел.: 8 (495) 120-60-95, 120-60-96.

*Примечание. Тест с анти-D IgG реагентом на наличие слабых антигенов или вариантов антигена D для реципиентов не проводят. Требования к проведению иммуногематологических исследований доноров и реципиентов на СПК и в ЛПУ. Методические указания № 2001/109 МЗ РФ. СПб. 2002 г.