Определение групп крови по антигенам эритроцитов АВ0, Резус и Келл: рекомендации по применению реагентов

Изосероклоны™ анти-А, анти-В, анти-АВ, анти-А1, анти-D IgM, анти-D IgG, анти-С IgM, анти-Е IgM, анти-с IgM, анти-К IgM предназначены для определения группы крови по соответствующим клинически значимым антигенам систем АВ0, Резус и Келл эритроцитов человека.

Принцип действия Изосероклонов™

Принцип действия реагентов основывается на реакции гемагглютинации. При типировании образцов крови реакция наступает в результате специфического взаимодействия Изосероклонов™ анти-А, анти-В, анти-АВ, анти-А1, анти-D IgM, анти-D IgG, анти-С IgM, анти-Е IgM, анти-с IgM, анти-К IgM с соответствующими антигенами эритроцитов. Фондом «МеДиКлон» производятся как отдельные реагенты, так и комплект для определения группы крови AB0, служащий для выявления антигенов A, B, AB, а также их слабых разновидностей.

Действующим началом реагентов являются:

  • мышиные моноклональные антитела (иммуноглобулины класса М) к антигенам А, В, АВ;
  • фитогемагглютинин (лектин), выявляющий подгруппы A1 и A2 антигена A;
  • человеческие моноклональные антитела (иммуноглобулины класса М) к D, С, Е, с, е и К;
  • человеческие моноклональные антитела (иммуноглобулины класса G) к антигену D.

Изосероклоны™, содержащие в своем составе иммуноглобулины класса М, используют в прямой реакции агглютинации на плоскости, в пробирках или планшете путём смешивания реагентов с исследуемыми образцами крови. Изосероклон™ анти-D IgG, действующим началом которого являются иммуноглобулины класса G, применяют в непрямой реакции агглютинации Кумбса или в реакции конглютинации с желатином в пробирочном тесте.

При типировании крови наступление агглютинации (положительная реакция) с помощью соответствующих Изосероклонов™ выражается в склеивании эритроцитов в отчетливо видимые агрегированные скопления клеток – агглютинаты и просветлении поля реакции. При отсутствии антигенов на исследуемых эритроцитах агглютинация не проявляется.

Об аналитических и диагностических характеристиках реагентов, входящих в комплект для определения группы крови AB0, и диагностикумов, используемых для типирования крови по другим антигенам, вы можете получить информацию в соответствующих разделах нашего сайта: Система АВ0Резус, Келл.

Проведение анализа с использованием Изосероклонов™

Изосероклоны™ являются эквивалентами цоликлонов. Исследования образцов крови с помощью Изосероклонов™ анти-А, анти-В, анти-АВ, анти-А1, анти-D IgM, анти-С IgM, анти-Е IgM, анти-с IgM, анти-К IgM проводят в реакции прямой гемагглютинации по одной общей методике, аналогичной методике определения групп крови цоликлонами. Поэтому все этапы проведения анализа, которые будут изложены и проиллюстрированы в виде фотофильма, применимы для всех перечисленных реагентов.

Методические рекомендации по применению реагента Изосероклон™ анти-D IgG вы можете посмотреть в разделе сайта «Порядок проведения анализа на наличие резус-фактора с использованием реагента анти-D IgG».

Меры предосторожности

При работе с анализируемыми образцами крови следует использовать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, т.к. образцы крови человека необходимо рассматривать как потенциально инфицированный материал, способный длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита и др. возбудителей инфекций.

Оборудование и материалы

  • пробирки стеклянные круглодонные вместимостью 2,0 – 5,0 мл;
  • пипетки пастеровские вместимостью 5,0 мл или полуавтоматическая пипетка со сменным объемом;
  • стеклянные или пластмассовые палочки для перемешивания капель крови и реагента;
  • физиологический раствор (0,9 % NaCl);
  • антиглобулиновый реагент (сыворотка Кумбса);
  • центрифуга, развивающая ускорение 2000 об./мин.;
  • термостат лабораторный или баня водяная, поддерживающие температуру 37 ± 1 °С;
  • перчатки резиновые или пластиковые;
  • стандартные положительные и отрицательные эритроциты, соответствующие по специфичности Изосероклонам™, входящим в состав набора.

Анализируемые образцы

Типирование производится в нативной крови, взятой в консервант; в крови, взятой без консерванта, в том числе взятой из пальца. При проведении исследования к Изосероклонам™ предъявляются те же требования, что и при определении групп крови цоликлонами.

Порядок проведения анализа

Используется метод прямой реакции гемагглютинации на плоскости – в планшете, на пластине; в пробирке. Результаты данного исследования могут использоваться для определения совместимости групп крови доноров и реципиентов при необходимости осуществления гемотрансфузии.

Реакция в планшете, на пластине

Необходимо промаркировать планшет или пластину, указав фамилию, имя, отчество исследуемого лица и специфичность используемого реагента.

Нанесите в лунку планшета или на плоскость одну маленькую (0,02 – 0,05 мл) каплю исследуемой крови (эритроцитов).

Для получения более выраженной и чёткой агглютинации предпочтительнее использовать эритроциты в высокой концентрации, отбирая их с помощью пипетки непосредственно из осадка анализируемых красных кровяных клеток.

Внимание! Использование образцов с низким содержанием эритроцитов (менее 50 %) может привести к увеличению срока наступления положительной реакции и затруднениям при оценке результатов.

Рядом с каплей или непосредственно в каплю крови внесите одну большую (около 0,1 мл) каплю соответствующего Изосероклона™.

Смешайте чистой стеклянной или пластмассовой палочкой каплю исследуемой крови с соответствующими реагентами из комплекта для определения группы крови по системе AB0 или с другими моноклональными тест-системами, выявляющими антигены Резус и Келл.

Через 20 - 30 сек. после смешивания необходимо мягко покачать планшет.

Затем положите его на горизонтальную поверхность до окончания проведения анализа. Результат реакции оцените визуально.

Обычно четкая агглютинация наступает через 60 секунд после смешивания реагента с красными кровяными клетками, но окончательный результат реакции следует учитывать через 5 мин.

Использование предварительно подогретой в термостате до температуры + 37 °С пластины сокращает время наступления агглютинации. Для более чёткой оценки результата по окончании времени проведения анализа рекомендуется добавить в каждую лунку с компонентами реакции по 1 - 3 каплям физиологического раствора, затем покачать планшет.

Реакция гемагглютинации в пробирках

Подготовьте из отмытых анализируемых эритроцитов 5 % взвесь в физиологическом растворе. Внесите в круглодонную пробирку 0,1 мл Изосероклона™ и одну каплю эритроцитарной взвеси, тщательно смешайте.

Инкубируйте пробирку в течение 30 мин. при температуре + 37 °С, а затем центрифугируйте в течение 30 сек. при 1500 - 2000 об./мин. при комнатной температуре (+ 15 - 25 °С). Добавьте 1 - 3 капли физиологического раствора. Осторожно встряхивая пробирку, отделите осадок от дна.

Результат оцените визуально. При положительном результате образуются один или несколько крупных агглютинатов на фоне прозрачного физиологического раствора. В случае отрицательного результата реакции осадок легко разбивается и представляет собой гомогенную непрозрачную суспензию.

Контроль специфичности

Для контроля специфичности (независимо от применяемой методики) с каждой серией анализируемых образцов необходимо проводить контрольные исследования перечисленных Изосероклонов™ с соответствующими им по специфичности стандартными положительными и отрицательными эритроцитами. Результаты учитывают только при наличии правильной реакции Изосероклонов™ с соответствующими им стандартными эритроцитами.

Определение совместимости групп крови донора и реципиента

Система AB0 была открыта в 1900 году австрийским ученым Карлом Ландштейнером. В основе определения группы крови Цоликлонами, Изосероклонами (так в России называются моноклональные антитела к антигенам эритроцитов человека) по AB0 лежит присутствие группоспецифических антигенов 0, A, B на поверхности красных кровяных клеток. В рамках данной системы выделяют 4 группы крови: 0 (I), A (II), B (III), AB (IV).

Аллельные гены передаются по наследству: один - от матери, другой – от отца. Группа крови формируется при рождении и остается неизменной в течение всей жизни. Особенностью AB0 является наличие в сыворотке естественных антител к отсутствующему антигену: анти-A (α) и анти-B (β) присутствуют у лиц группы 0 (I); β - у лиц A (II); α - у лиц B (III); у людей, относящихся к AB (IV), антитела отсутствуют. Α и β не являются иммунными и относятся к классу IgM. Помимо естественных, существуют также иммунные IgG-антитела, которые могут образовываться у реципиентов при трансфузиях AB0-несовместимых эритроцитов донора. В случае смешивания одноименных антител и антигенов происходит гемолиз красных кровяных клеток, и кровь теряет возможность выполнять свою функцию (смотрите таблицу ниже).

Говоря о совместимости групп крови по AB0, недопустимо, к примеру, переливание крови A (II) больному, имеющему B (III), в силу взаимодействия антител α реципиента с антигенами A донора. A (II) и AB (IV) подразделяются на подгруппы A1 и A2, A1B и A2B, соответственно. При этом кровь подгрупп A2 и A2B может в редких случаях содержать анти-A1-антитела, которые, в свою очередь, агглютинируют эритроциты группы A.

Второй по значимости после AB0 является система антигенов Резус, которая была открыта в 1939 году врачами Левином и Стетсоном. Она включает 45 антигенов, наибольшую клиническую важность представляют D, c, E, C, e (перечислены в порядке убывания иммуногенности). 86 % жителей Российской Федерации являются резус-положительными по антигену D. Антитела против антигенов Резус могут быть только иммунными и образуются вследствие изосенсибилизации. При контакте крови резус-отрицательного реципиента и резус-положительного донора происходит выработка анти-D антител у реципиента, которые агглютинируют антигены D (смотрите таблицу совместимости). В редких случаях встречаются разновидности ослабленного антигена Du и частичного антигена DI – DVII, иммунная система обладателей которых также способна продуцировать анти-D антитела.

Следующей по значимости является система Келл-Челано. Среди антигенов, представляющих наибольшую клиническую важность, является фактор K. В соответствии с приказом МЗ РФ № 2 от 09.04.1998 в обязательном порядке производится типирование крови доноров по Келл-Челано. В случае обнаружения антигена K эритроциты донора не принимаются ЛПУ для осуществления гемотрансфузий. Антитела анти-K являются иммунными, в основном они относятся к IgG, в ряде случаев к IgM-классу.

Приводим вашему вниманию таблицу совместимости групп крови доноров и реципиентов по антигенам AB0 и антигену D системы Резус.

  Донор
Реципиент Группа крови 0 (I) Rh– 0 (I) Rh+ B (III) Rh- B (III) Rh+ А (II) Rh- А (II) Rh+ AB (IV) Rh- AB (IV) Rh+
AB (IV) Rh+ + + + + + + + +
AB (IV) Rh- +   +   +   +  
А (II) Rh+ + +     + +    
А (II) Rh- +       +      
B (III) Rh+ + + + +        
B (III) Rh- +   +          
0 (I) Rh+ + +            
0 (I) Rh– +              

Определение совместимости групп крови донора и реципиента с использованием Цоликлонов, Изосероклонов по AB0, Резус и Келл позволяет предотвратить возникновение гемолитических реакций, которые могут закончиться летальным исходом. Как видно из таблицы, 0 (I) Rh– совместима со всеми остальными группами крови. Ее обладатели являются универсальными донорами. Противоположная ситуация наблюдается у AB (IV) Rh+: ее обладателям может быть перелита любая группа крови. Другими словами, лица с AB (IV) Rh+ являются универсальными реципиентами. В целом, при осуществлении гемотрансфузий необходимо руководствоваться следующим правилом: антитела реципиента и антигены донора не должны вступать в реакцию агглютинации.