Определение групп крови по антигенам эритроцитов АВ0, Резус и Келл: рекомендации по применению реагентов

Содержание:

Изосероклоны™ анти-А, анти-В, анти-АВ, анти-А1, анти-D IgM, анти-D IgG, анти-С IgM, анти-Е IgM, анти-с IgM, анти-К IgM предназначены для определения группы крови по соответствующим клинически значимым антигенам систем АВ0, Резус и Келл эритроцитов человека.

Изосероклоны рекомендации по применению Методические рекомендации по применению Изосероклонов™

Принцип действия Изосероклонов™

Принцип действия реагентов основывается на реакции гемагглютинации. При типировании образцов крови реакция наступает в результате специфического взаимодействия Изосероклонов™ анти-А, анти-В, анти-АВ, анти-А1, анти-D IgM, анти-D IgG, анти-С IgM, анти-Е IgM, анти-с IgM, анти-К IgM с соответствующими антигенами эритроцитов. Фондом «МеДиКлон» производятся как отдельные реагенты, так и комплект для определения группы крови AB0, служащий для выявления антигенов A, B, AB, а также их слабых разновидностей.

Действующим началом реагентов являются:

  • мышиные моноклональные антитела (иммуноглобулины класса М) к антигенам А, В, АВ;
  • фитогемагглютинин (лектин), выявляющий подгруппы A1 и A2 антигена A;
  • человеческие моноклональные антитела (иммуноглобулины класса М) к D, С, Е, с, е и К;
  • человеческие моноклональные антитела (иммуноглобулины класса G) к антигену D.

Изосероклоны™, содержащие в своем составе иммуноглобулины класса М, используют в прямой реакции агглютинации на плоскости, в пробирках или планшете путём смешивания реагентов с исследуемыми образцами крови. Изосероклон™ анти-D IgG, действующим началом которого являются иммуноглобулины класса G, применяют в непрямой реакции агглютинации Кумбса или в реакции конглютинации с желатином в пробирочном тесте.

При выявлении групп крови наступление агглютинации (положительная реакция) с помощью соответствующих Изосероклонов™ выражается в склеивании эритроцитов в отчетливо видимые агрегированные скопления клеток – агглютинаты и просветлении поля реакции. При отсутствии антигенов на исследуемых эритроцитах агглютинация не проявляется.

Об аналитических и диагностических характеристиках реагентов, входящих в комплект для определения группы крови AB0, и диагностикумов, используемых для типирования крови по другим антигенам, вы можете получить информацию в соответствующих разделах нашего сайта: Система АВ0Резус, Келл.

Проведение анализа с использованием Изосероклонов™

Изосероклоны™ являются эквивалентами цоликлонов. Исследования образцов крови с помощью Изосероклонов™ анти-А, анти-В, анти-АВ, анти-А1, анти-D IgM, анти-С IgM, анти-Е IgM, анти-с IgM, анти-К IgM проводят в реакции прямой гемагглютинации по одной общей методике, аналогичной методике определения групп крови цоликлонами. Поэтому все этапы проведения анализа, которые будут изложены и проиллюстрированы в виде фотофильма, применимы для всех перечисленных реагентов.

Методические рекомендации по применению реагента Изосероклон™ анти-D IgG вы можете посмотреть в разделе сайта «Порядок проведения анализа на наличие резус-фактора с использованием реагента анти-D IgG».

Меры предосторожности

При работе с анализируемыми образцами крови следует использовать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, т.к. образцы крови человека необходимо рассматривать как потенциально инфицированный материал, способный длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита и др. возбудителей инфекций.

Оборудование и материалы

  • пробирки стеклянные круглодонные вместимостью 2,0 – 5,0 мл;
  • пипетки пастеровские вместимостью 5,0 мл или полуавтоматическая пипетка со сменным объемом;
  • стеклянные или пластмассовые палочки для перемешивания капель крови и реагента;
  • физиологический раствор (0,9 % NaCl);
  • антиглобулиновый реагент (сыворотка Кумбса);
  • центрифуга, развивающая ускорение 2000 об./мин.;
  • термостат лабораторный или баня водяная, поддерживающие температуру 37 ± 1 °С;
  • перчатки резиновые или пластиковые;
  • стандартные положительные и отрицательные эритроциты, соответствующие по специфичности Изосероклонам™, входящим в состав набора.

Анализируемые образцы

Типирование производится в нативной крови, взятой в консервант; в крови, взятой без консерванта, в том числе взятой из пальца. При проведении исследования к Изосероклонам™ предъявляются те же требования, что и при определении групп крови цоликлонами.

Порядок проведения анализа

Используется метод прямой реакции гемагглютинации на плоскости – в планшете, на пластине; в пробирке. Результаты данного исследования могут использоваться для определения совместимости групп крови доноров и реципиентов при необходимости осуществления гемотрансфузии.

Реакция в планшете, на пластине

Необходимо промаркировать планшет или пластину, указав фамилию, имя, отчество исследуемого лица и специфичность используемого реагента.

Маркировка планшета при определении группы крови Маркировка планшета

Нанесите в лунку планшета или на плоскость одну маленькую (0,02 – 0,05 мл) каплю исследуемой крови (эритроцитов).

Добавление эритроцитовДобавление эритроцитов

Для получения более выраженной и чёткой агглютинации предпочтительнее использовать эритроциты в высокой концентрации, отбирая их с помощью пипетки непосредственно из осадка анализируемых красных кровяных клеток.

Внимание! Использование образцов с низким содержанием эритроцитов (менее 50 %) может привести к увеличению срока наступления положительной реакции и затруднениям при оценке результатов.

Рядом с каплей или непосредственно в каплю крови внесите одну большую (около 0,1 мл) каплю соответствующего Изосероклона™.

Добавление ИзосероклонаДобавление Изосероклона™

Смешайте чистой стеклянной или пластмассовой палочкой каплю исследуемой крови с соответствующими реагентами из комплекта для определения группы крови по системе AB0 или с другими моноклональными тест-системами, выявляющими антигены Резус и Келл.

Перемешивание крови с реагентамиПеремешивание крови с реагентами

Через 20 - 30 сек. после смешивания необходимо мягко покачать планшет.

Покачивание планшета для типирования кровиПокачивание планшета

Затем положите его на горизонтальную поверхность до окончания проведения анализа по выявлению групп крови. Результат реакции оцените визуально.

Оценка результата реакции гемагглютинацииОценка результата реакции гемагглютинации

Обычно четкая агглютинация наступает через 60 секунд после смешивания реагента с красными кровяными клетками, но окончательный результат реакции следует учитывать через 5 мин.

Наступление агглютинацииНаступление агглютинации

Использование предварительно подогретой в термостате до температуры + 37 °С пластины сокращает время наступления агглютинации. Для более чёткой оценки результата по окончании времени проведения анализа рекомендуется добавить в каждую лунку с компонентами реакции по 1 - 3 каплям физиологического раствора, затем покачать планшет.

Реакция гемагглютинации в пробирках

Подготовьте из отмытых анализируемых эритроцитов 5 % взвесь в физиологическом растворе. Внесите в круглодонную пробирку 0,1 мл Изосероклона™ и одну каплю эритроцитарной взвеси, тщательно смешайте.

Инкубируйте пробирку в течение 30 мин. при температуре + 37 °С, а затем центрифугируйте в течение 30 сек. при 1500 - 2000 об./мин. при комнатной температуре (+ 15 - 25 °С). Добавьте 1 - 3 капли физиологического раствора. Осторожно встряхивая пробирку, отделите осадок от дна.

Результат оцените визуально. При положительном результате образуются один или несколько крупных агглютинатов на фоне прозрачного физиологического раствора. В случае отрицательного результата реакции осадок легко разбивается и представляет собой гомогенную непрозрачную суспензию.

Контроль специфичности

Для контроля специфичности (независимо от применяемой методики выявления групп крови) с каждой серией анализируемых образцов необходимо проводить контрольные исследования перечисленных Изосероклонов™ с соответствующими им по специфичности стандартными положительными и отрицательными эритроцитами. Результаты учитывают только при наличии правильной реакции Изосероклонов™ с соответствующими им стандартными эритроцитами.

Определение совместимости групп крови донора и реципиента

Система AB0 была открыта в 1900 году австрийским ученым Карлом Ландштейнером. В основе определения группы крови Цоликлонами, Изосероклонами (так в России называются моноклональные антитела к антигенам эритроцитов человека) по AB0 лежит присутствие группоспецифических антигенов 0, A, B на поверхности красных кровяных клеток. В рамках данной системы выделяют 4 группы крови: 0 (I), A (II), B (III), AB (IV).

Аллельные гены передаются по наследству: один - от матери, другой – от отца. Группа крови формируется при рождении и остается неизменной в течение всей жизни. Особенностью AB0 является наличие в сыворотке естественных антител к отсутствующему антигену: анти-A (α) и анти-B (β) присутствуют у лиц группы 0 (I); β - у лиц группы A (II); α - у лиц группы B (III); у людей, относящихся к группе AB (IV), антитела отсутствуют. α и β не являются иммунными и относятся к классу IgM. Помимо естественных, существуют также иммунные IgG-антитела, которые могут образовываться у реципиентов при трансфузиях AB0-несовместимых эритроцитов донора. В случае смешивания одноименных антител и антигенов происходит гемолиз красных кровяных клеток, и кровь теряет возможность выполнять свою функцию (смотрите таблицу совместимости групп крови ниже).

Говоря о совместимости групп крови по AB0, недопустимо, к примеру, переливание крови группы A (II) больному, имеющему группу B (III), в силу взаимодействия антител α реципиента с антигенами A донора. A (II) и AB (IV) подразделяются на подгруппы A1 и A2, A1B и A2B, соответственно. При этом кровь подгрупп A2 и A2B может в редких случаях содержать анти-A1-антитела, которые, в свою очередь, агглютинируют эритроциты группы A.

Второй по значимости после AB0 является система антигенов Резус, которая была открыта в 1939 году врачами Левином и Стетсоном. Она включает 45 антигенов, наибольшую клиническую важность представляют D, c, E, C, e (перечислены в порядке убывания иммуногенности). 86 % жителей Российской Федерации являются резус-положительными по антигену D. Антитела против антигенов Резус могут быть только иммунными и образуются вследствие изосенсибилизации. При контакте крови резус-отрицательного реципиента и резус-положительного донора происходит выработка анти-D антител у реципиента, которые агглютинируют антигены D (смотрите таблицу совместимости групп крови). В редких случаях встречаются разновидности ослабленного антигена Du и частичного антигена DI – DVII, иммунная система обладателей которых также способна продуцировать анти-D антитела.

Следующей по значимости является система групп крови Келл-Челано. Среди антигенов, представляющих наибольшую клиническую важность, является фактор K. В соответствии с приказом МЗ РФ № 2 от 09.04.1998 в обязательном порядке производится типирование крови доноров по Келл-Челано. В случае обнаружения антигена K эритроциты донора не принимаются ЛПУ для осуществления гемотрансфузий. Антитела анти-K являются иммунными, в основном они относятся к IgG, в ряде случаев к IgM-классу.

Приводим вашему вниманию таблицу совместимости групп крови доноров и реципиентов по антигенам AB0 и антигену D системы Резус.

  Донор
Реципиент Группа крови 0 (I) Rh– 0 (I) Rh+ B (III) Rh- B (III) Rh+ А (II) Rh- А (II) Rh+ AB (IV) Rh- AB (IV) Rh+
AB (IV) Rh+ + + + + + + + +
AB (IV) Rh- +   +   +   +  
А (II) Rh+ + +     + +    
А (II) Rh- +       +      
B (III) Rh+ + + + +        
B (III) Rh- +   +          
0 (I) Rh+ + +            
0 (I) Rh– +              

Определение совместимости групп крови донора и реципиента с использованием Цоликлонов, Изосероклонов по AB0, Резус и Келл позволяет предотвратить возникновение гемолитических реакций, которые могут закончиться летальным исходом. Как видно из таблицы, 0 (I) Rh– совместима со всеми остальными группами крови. Ее обладатели являются универсальными донорами. Противоположная ситуация наблюдается у AB (IV) Rh+: ее обладателям может быть перелита любая группа крови. Другими словами, лица с AB (IV) Rh+ являются универсальными реципиентами. В целом, при осуществлении гемотрансфузий необходимо руководствоваться следующим правилом: антитела реципиента и антигены донора не должны вступать в реакцию агглютинации.