Методические рекомендации по практическому применению реагентов для определения групп крови человека по антигенам эритроцитов АВ0, Резус и Келл

Изосероклонытм анти-А, анти-В, анти-АВ, анти-А1, анти-DIgM, анти-DIgG, анти-СIgM, анти-ЕIgM, анти-сIgM, анти-КIgM предназначены для определения группы крови по соответствующим клинически значимым антигенам систем АВ0, Резус и Келл эритроцитов человека.

Принцип действия Изосероклоновтм

Принцип действия реагентов основывается на реакции гемагглютинации. При типировании образцов крови по антигенам эритроцитов реакция наступает в результате специфического взаимодействия Изосероклоновтм анти-А, анти-В, анти-АВ, анти-А1, анти-DIgM, анти-DIgG, анти-СIgM, анти-ЕIgM, анти-сIgM, анти-КIgM с соответствующими антигенами эритроцитов.

Действующим началом реагентов для определения группы крови являются:

  • мышиные моноклональные антитела (иммуноглобулины класса М) к антигенам А, В, АВ;
  • фитогемагглютинин (лектин) к антигену А;
  • человеческие моноклональные антитела (иммуноглобулины класса М) к антигенам D, С, Е, с, е и К;
  • человеческие моноклональные антитела (иммуноглобулины класса G) к антигену D.

Изосероклонытм, содержащие в своем составе иммуноглобулины класса М, используют в прямой реакции агглютинации на плоскости, в пробирках или планшете путём смешивания реагентов с исследуемыми образцами крови (эритроцитов). Изосероклонтм анти-DIgG, действующим началом которого являются иммуноглобулины класса G, применяют в непрямой реакции агглютинации Кумбса или в реакции конглютинации с желатином в пробирочном тесте.

Наступление агглютинации (положительная реакция) при типировании крови с помощью соответствующих Изосероклоновтм выражается в склеивании эритроцитов в отчетливо видимые агрегированные скопления клеток – агглютинаты и просветлении поля реакции. При отсутствии антигенов на исследуемых эритроцитах, агглютинация не появляется.

Об аналитических и диагностических характеристиках реагентов, входящих в комплект для определения групп крови, вы можете получить информацию в соответствующих разделах нашего сайта: Система АВ0, Ситема Резус, Система Келл.

Проведение анализа с использованием Изосероклоновтм

Изосероклонытм являются эквивалентами цоликлонов. Исследования образцов крови с помощью Изосероклоновтм анти-А, анти-В, анти-АВ, анти-А1, анти-DIgM, анти-СIgM, анти-ЕIgM, анти-сIgM, анти-КIgM проводят в реакции прямой гемагглютинации по одной общей методике, аналогичной методике определения групп крови с помощью цоликлонов. Поэтому все этапы проведения анализа, которые будут изложены и проиллюстрированы в виде фотофильма, применимы для всех перечисленных реагентов.

Методические рекомендации по применению реагента Изосероклонтм анти-D IgG вы можете посмотреть в разделе сайта "Порядок проведения анализа на наличие резус-фактора с использованием реагента анти-D IgG".

Меры предосторожности

При работе с анализируемыми образцами крови следует использовать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, т.к. образцы крови человека необходимо рассматривать как потенциально инфицированный материал, способный длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита и др. возбудителей инфекций.

Оборудование и материалы

  • пробирки стеклянные круглодонные вместимостью 2,0 – 5,0 мл;
  • пипетки пастеровские вместимостью 5,0 мл или полуавтоматическая пипетка со сменным объемом;
  • стеклянные или пластмассовые палочки для перемешивания капель крови и реагента;
  • физиологический раствор (0,9 % NaCl);
  • антиглобулиновый реагент (сыворотка Кумбса);
  • центрифуга, развивающая ускорение 2000 об./мин.;
  • термостат лабораторный или баня водяная, поддерживающие температуру 37 ± 1 °С;
  • перчатки резиновые или пластиковые;
  • стандартные положительные и отрицательные эритроциты, соответствующие по специфичности Изосероклонамтм, входящим в состав набора.

Анализируемые образцы

Определение производится в нативной крови, взятой в консервант; в крови, взятой без консерванта, в том числе взятой из пальца. При проведении исследования к Изосероклонамтм предъявляются те же требования, что и при определении группы крови цоликлонами.

Порядок проведения анализа по типированию антигенов эритроцитов

Используется метод прямой реакции гемагглютинации на плоскости – в планшете, на пластине, в пробирке. Результаты данного исследования могут использоваться, в том числе для определения совместимости групп крови доноров и реципиентов при необходимости переливания крови.

Реакция прямой гемагглютинации в планшете или на пластине

Необходимо промаркировать планшет или пластину, указав фамилию, имя, отчество исследуемого лица и специфичность используемого реагента.

Нанесите в лунку планшета или на плоскость одну маленькую (0,02 – 0,05 мл) каплю исследуемой крови (эритроцитов).

Для получения более выраженной и чёткой агглютинации предпочтительнее использовать эритроциты в высокой концентрации, отбирая их с помощью пипетки непосредственно из осадка анализируемых эритроцитов.

Внимание! Использование образцов с низким содержанием эритроцитов (менее 50%) может привести к увеличению срока наступления положительной реакции и затруднениям при оценке результатов.

Рядом с каплей или непосредственно в каплю крови внесите одну большую (около 0,1 мл) каплю соответствующего Изосероклонатм.

Смешайте чистой стеклянной или пластмассовой палочкой каплю исследуемой крови (эритроцитов) с реагентом комплекта для определения группы крови.

Через 20 - 30 сек. после смешивания необходимо мягко покачать планшет.

Затем положите его на горизонтальную поверхность до окончания проведения анализа по определению групп крови.

Результат реакции оцените визуально.

Обычно четкая агглютинация наступает через 60 секунд после смешивания реагента с эритроцитами, но окончательный результат реакции следует учитывать через 5 мин.

Использование предварительно подогретой в термостате до температуры + 37 °С пластины сокращает время наступления агглютинации. Для более чёткой оценки результата по окончании времени проведения анализа рекомендуется добавить в каждую лунку с компонентами реакции по 1 - 3 каплям физиологического раствора, затем покачать планшет.

Реакция гемагглютинации в пробирках

Подготовьте из отмытых анализируемых эритроцитов 5 % взвесь в физиологическом растворе. Внесите в круглодонную пробирку 0,1 мл Изосероклонатм и одну каплю эритроцитарной взвеси, тщательно смешайте.

Инкубируйте пробирку в течение 30 мин. при температуре +37 °С, а затем центрифугируйте пробирку в течение 30 сек. при 1500 - 2000 об./мин. при комнатной температуре (+ 15 - 25 °С). Добавьте в пробирку 1 - 3 капли физиологического раствора. Осторожно встряхивая пробирку, отделите осадок от дна.

Результат оцените визуально. При положительном результате образуются один или несколько крупных агглютинатов на фоне прозрачного физиологического раствора. В случае отрицательного результата реакции осадок легко разбивается и представляет собой гомогенную непрозрачную суспензию эритроцитов.

Контроль специфичности

Для контроля специфичности (независимо от применяемой методики исследования) с каждой серией анализируемых образцов крови необходимо проводить контрольные исследования перечисленных Изосероклоновтм с соответствующими им по специфичности стандартными положительными и отрицательными эритроцитами. Результаты учитывают только при наличии правильной реакции Изосероклоновтм с соответствующими им стандартными эритроцитами.