Анализ крови на наличие резус-фактора. Инструкция к анти-D IgG

ИзосероклонТМ анти-D IgG используется для анализа на наличие резус-фактора с помощью определения антигена D эритроцитов, включая слабый антиген D (Du) и варианты DI - DVII, в непрямом антиглобулиновом тесте (непрямая реакция Кумбса) или в реакции конглютинации с желатином в пробирочном тесте.

Варианты использования анти-D IgG:

  • в качестве дополнительного, уточняющего реагента для выявления частичных вариантов антигена D (DI - DVII) в образцах эритроцитов доноров, которые в реакции с моноклональными анти-D IgM реагентами были определены как D-отрицательные*;
  • в качестве самостоятельного реагента для анализа крови на наличие резус-фактора: определение всех разновидностей антигена D - D; Du; DI - DVII.

Механизм действия анти-D IgG

Механизм действия основывается на реакции гемагглютинации, происходящей ввиду специфического взаимодействия антигенов D, Du или DI - DVII эритроцитов с реагентом анти-D IgG. Основа анти-D IgG - человеческие моноклональные IgG-антитела, которые продуцируются гетерогибридомной линией клеток человек-мышь. Для изготовления ИзосероклонТМ анти-D IgG применяется культуральная питательная среда, в которой содержатся анти-D IgG антитела.

Реагент анти-D IgG для анализа на наличие резус-фактора используют в непрямом антиглобулиновом тесте (непрямая реакция Кумбса) или в реакции конглютинации с желатином в пробирочном тесте посредством смешивания анти-D IgG с образцами исследуемой крови. При наличии антигена D и его разновидностей (Du; DI - DVII) происходит склеивание эритроцитов в агглютинаты и просветление поля реакции. При отсутствии антигена D и его разновидностей агглютинация не проявляется.

Фасовка

  • 5 или 10 бутылочек реагента для анализа крови человека на наличие резус-фактора (вместимостью 2,0; 5,0 или 10 мл каждая).

Специфичность и титр

  • Реагент агглютинирует все разновидности D-положительных эритроцитов и не осуществляет агглютинацию с D-отрицательными эритроцитами.
  • Титр в непрямом антиглобулиновом тесте (непрямой пробе Кумбса) или в реакции конглютинации с желатином в пробирочном тесте - не менее 1:128.

Материалы, реагенты, оборудование

  • стеклянные пробирки объемом 2,0 - 5,0 мл;
  • пастеровские пипетки вместимостью 5,0 мл или полуавтоматическая пипетка со сменным объемом;
  • 0,9 % раствор хлорида натрия или раствор с низкой ионной силой - LISS;
  • антиглобулиновый реагент (сыворотка Кумбса);
  • 10 % желатин;
  • центрифуга, обеспечивающая ускорение 2000 об./мин;
  • термостат лабораторный или баня водяная, поддерживающие температуру + 37 ± 1 °С и + 48 ± 1 °С;
  • химические перчатки;
  • тест-эритроциты Rh+ и Rh-.

Последовательность выполнения действий

Реагент моноклональный используется в непрямом антиглобулиновом тесте (непрямой пробе Кумбса) или в пробирочном тесте в реакции конглютинации с желатином.

Непрямой антиглобулиновый тест (непрямая проба Кумбса)

  • Приготовить образец исследуемой крови. Для этого в пробирку внести примерно 0,25 мл крови, 3 раза отмыть эритроциты в 5 мл раствора NaCl; ресуспендировать осадок в 2 - 3 мл физиологического раствора или в растворе с низкой ионной силой - LISS для получения 2 - 5 % суспензии исследуемых эритроцитов.
  • Промаркировать чистую пробирку, указав ФИО исследуемого лица.
  • Внести в пробирку одну каплю (приблизительно 0,1 мл) реагента.
  • Добавить одну каплю 2 - 5 % суспензии эритроцитов, смешать с реагентом для анализа крови на наличие резус-фактора анти-D IgG.
  • Инкубировать смесь в термостате или на водяной бане при температуре + 37 °С в течение 10 - 15 мин.
  • Добавить в пробирку 5 мл раствора NaCl. Центрифугировать пробирку со смесью в течение 2 - 5 мин. при 2000 об./мин. Полностью удалить физиологический раствор.
  • Добавить одну каплю (приблизительно 0,1 мл) антиглобулинового реагента к осадку эритроцитов и тщательно перемешать.
  • Центрифугировать пробирку с исследуемым образцом эритроцитов в течение 15 - 20 секунд при 2000 об./мин.
  • Осторожно ресуспендировать осадок эритроцитов и визуально определить наличие или отсутствие агглютинации. При положительном результате на дне пробирки образуются крупные агглютинаты. Менее выраженная агглютинация свидетельствует о наличии на эритроцитах вариантов антигена D (DI - DVII). При отрицательном результате осадок без труда разбивается и является непрозрачной суспензией эритроцитов.

Реакция конглютинации с желатином в пробирочном тесте

  • Промаркировать чистую пробирку, указав ФИО исследуемого лица.
  • В пробирку внести одну каплю (0,05 - 0,1 мл) исследуемой крови.
  • Добавить две капли по 0,1 мл 10 % желатина, предварительно прогретого в термостате или на водяной бане при температуре + 48 °С до разжижения.
  • Добавить две капли по 0,1 мл реагента анти-D IgG, тщательно перемешать суспензию.
  • Инкубировать в течение 10 - 15 мин. на водяной бане или 30 мин. в термостате при температуре + 48 °С.
  • Добавить в пробирку 5 мл раствора NaCl, закрыть её резиновой пробкой, а затем осторожно перевернуть пробирку 1 - 2 раза.
  • Провести визуальный учет результатов. В случае положительного результата образуются крупные агглютинаты на фоне прозрачного раствора. Менее выраженная агглютинация свидетельствует о наличии на эритроцитах вариантов антигена D (DI - DVII). При отрицательном результате образуется равномерная, непрозрачная суспензия эритроцитов.

Контроль специфичности

Со всеми сериями изучаемых образцов крови требуется выполнять контрольные исследования реагента анти-D IgG с тест-эритроцитами Rh+ и Rh-. Учет результатов возможен лишь в случае корректной реакции анти-D IgG со стандартными эритроцитами.

 
 

*Требования к проведению иммуногематологических исследований доноров и реципиентов на СПК и в ЛПУ. Методические указания № 2001/109 МЗ РФ. СПб. 2002 г.