Определение резус-фактора крови — антигена D системы Резус

Изосероклон^ТМ анти-D IgM применяется для определения резус-фактора крови человека посредством обнаружения антигена D эритроцитов в реакции прямой гемагглютинации. Изосероклон^ТМ анти-D IgM вызывает агглютинацию большинства исследуемых D-положительных образцов крови за исключением образцов эритроцитов, содержащих частичный антиген D - вариант D^VI.

Антиген D в образцах крови доноров определяют с помощью анти-D IgM реагента. При отрицательных результатах в реакции с анти-D IgM реагентом образцы крови доноров дополнительно исследуют на наличие слабых антигенов или вариантов антигена D с анти-D IgG реагентом. Антиген D в образцах крови реципиентов определяют с помощью анти-D IgM реагента. Тест с анти-D IgG реагентом на наличие слабых антигенов или вариантов антигена D для реципиентов не проводят.

Изосероклоны являются эквивалентами цоликлонов, и в связи с этим при определении RhD-принадлежности крови к ним предъявляются те же требования, что и при определении резус-фактора цоликлонами.

Основа анти-D IgM

Основа действия анти-D IgM — реакция гемагглютинации. Реакция наступает в результате специфического взаимодействия антигена D эритроцитов с реагентом. Действующее начало анти-D IgM — моноклональные IgM-антитела человека, которые, как и для реагента анти-D IgG, производятся гибридомами мыши.

Реагент для определения резус-фактора используют в реакции прямой агглютинации путем его смешивания с исследуемыми эритроцитами. Наступление агглютинации (положительная реакция) выражается в склеивании эритроцитов в отчетливо видимые агрегированные скопления клеток — агглютинаты и просветлении поля реакции. При взаимодействии анти-D IgM реагента с D-отрицательными эритроцитами или эритроцитами, содержащими частичный вариант антигена D - D^VI, агглютинация не появляется.

Состав набора

5 или 10 флаконов Изосероклон^ТМ анти-D IgM для определения резус-фактора (объем одного флакона — 2,0; 5,0; 10 мл).

Характеристики анти-D IgM

Специфичность:

анти-D IgM агглютинирует D-положительные эритроциты и не агглютинирует D-отрицательные, а также эритроциты, содержащие разновидность антигена D — частичный антиген D^VI.

Титр:

титр в реакции агглютинации в планшете — не менее 1:128.

Авидность:

время наступления агглютинации D-положительных эритроцитов с реагентом в реакции на плоскости не превышает 60 сек.

Меры предосторожности

При работе с анализируемыми образцами крови следует использовать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, т.к. образцы крови человека необходимо рассматривать как потенциально инфицированный материал, способный длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита и др. возбудителей инфекций.

Анализируемые пробы

Определение производится в нативной крови, взятой в консервант; в крови, взятой без консерванта, в том числе взятой из пальца. Максимальный срок хранения образцов крови, предназначенных для исследования, — не более 3 суток при температуре от + 2 до + 8 °С.

Оборудование, материалы и реагенты

белые пластины со смачиваемой поверхностью;
планшеты круглодонные для иммунологических реакций;
круглодонные пробирки из стекла (2,0 — 5,0 мл);
стеклянные или пластмассовые палочки для перемешивания капель крови и реагентов;
пипетки пастеровские вместимостью 5,0 мл;
0,9 % физиологический раствор;
центрифуга, создающая ускорение 2000 об./мин.;
термостат, поддерживающий температуру + 37 ± 1 °С;
лабораторные перчатки;
стандартные эритроциты: D-положительные и D-отрицательные.

Порядок проведения анализа

Определение RhD-принадлежности крови с использованием моноклональных реагентов проводится по одной общей методике, что и при определении резус-фактора цоликлонами. Используется метод реакции прямой гемагглютинации на плоскости, в пробирках или в планшете. Определение производится в помещении с хорошим освещением при комнатной температуре от + 18 до + 25 °С.

Реакция гемагглютинации на плоскости

Необходимо промаркировать пластину, указав фамилию, имя, отчество исследуемого лица и специфичность используемого реагента.
Нанести на плоскость одну большую каплю (около 0,1 мл) реагента.
Рядом с реагентом нанести одну маленькую (0,01 — 0,05 мл) каплю исследуемой крови (эритроцитов). Для получения более выраженной и четкой агглютинации рекомендуется использовать эритроциты в высокой концентрации.
Смешать чистой стеклянной палочкой каплю исследуемой крови (эритроцитов) с реагентом.
Через 20 — 30 сек. после смешивания необходимо мягко покачивать пластину в течение 10 — 20 сек.
Результат реакции оценить визуально. Обычно четкая агглютинация наступает через 60 секунд после смешивания реагента для определения резус-фактора с эритроцитами, но окончательный результат реакции следует учитывать через 3 мин., но не позднее, т.к. при подсыхании капли может наблюдаться мелкая неспецифическая агглютинация. Использование предварительно подогретой в термостате до температуры + 37 °С пластины сокращает время наступления агглютинации.

Реакция гемагглютинации в пробирках

Приготовить из отмытых анализируемых эритроцитов 5 % взвесь в физиологическом растворе.
Внести в круглодонную пробирку 0,1 мл реагента и одну каплю эритроцитарной взвеси, тщательно смешать.
Инкубировать пробирку в течение 30 мин. при температуре + 37 °С.
Центрифугировать пробирку в течение 30 сек. при 1500 — 2000 об./мин. при комнатной температуре 18 — 25 °С.
Осторожно встряхивая пробирку, отделить осадок от дна.
Провести визуальную оценку. В случае положительного результата образуются 1 или несколько агглютинатов на фоне прозрачного раствора хлорида натрия. При отрицательном результате осадок с легкостью разбивается и представляет собой гомогенную непрозрачную взвесь эритроцитов.

Реакция гемагглютинации в планшете

В лунку круглодонного планшета внести 50 мкл Изосероклона^ТМ анти-D IgM и 50 мкл 5 % взвеси эритроцитов в физиологическом растворе. Перемешать пипетированием. Инкубировать планшет в течение 60 мин. при комнатной температуре. Результат реакции оценить визуально по характеру осадка эритроцитов на дне лунки. При положительном результате агглютинаты равномерно выстилают дно лунки и имеют неровные четко очерченные края. При отрицательном результате эритроциты образуют на дне лунки осадок в виде точки.

Контроль

С каждой серией образцов крови следует осуществлять контрольные исследования анти-D IgM с D-положительными и D-отрицательными тест-эритроцитами. Результаты считаются достоверными исключительно при наличии правильной реакции анти-D IgM с тест-эритроцитами.

Условия хранения и эксплуатации

Реагент для определения резус-фактора должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре от + 2 до + 8 °С в течение всего срока годности. Допускается хранение реагента при температуре до + 25 °С не более 10 сут. Вскрытые флаконы с реагентом можно хранить при температуре от + 2 до + 8 °С в плотно закрытом виде не более 1 мес.